Николай Иванович родился в Москве в 1810 году, в семье военного казначея, майора Ивана Ивановича Пирогова (1772—-1825). Четырнадцатилетним мальчиком поступил на медицинский факультет Московского университета. Получив диплом, ещё несколько лет учился за границей. К профессорской деятельности Пирогов готовился в Профессорском институте при Дерптском университете (ныне Тартуский университет). Здесь, в хирургической клинике, Пирогов проработал пять лет, блестяще защитил докторскую диссертацию и в возрасте всего лишь двадцати шести лет был избран профессором Дерптского университета. Через несколько лет Пирогов был приглашён в Петербург, где возглавил кафедру хирургии в Медико-хирургической Академии. Одновременно Пирогов руководил организованной им Клиникой госпитальной хирургии. Поскольку в обязанности Пирогова входило обучение военных хирургов, он занялся изучением распространённых в те времена хирургических методов. Многие из них были им в корне переработаны; кроме того, Пирогов разработал ряд совершенно новых приёмов, благодаря чему ему удавалось чаще, чем другим хирургам, избегать ампутации конечностей. Один из таких приёмов до настоящего времени называется «операцией Пирогова».

В поисках действенного метода обучения, Пирогов решил применить анатомические исследования на замороженных трупах. Сам Пирогов это называл «ледяной анатомией». Так родилась новая медицинская дисциплина — топографическая анатомия. Спустя несколько лет такого изучения анатомии, Пирогов издал первый анатомический атлас под заглавием «Топографическая анатомия, иллюстрированная разрезами, проведёнными через замороженное тело человека в трёх направлениях», ставший незаменимым руководством для врачей-хирургов. С этого момента хирурги получили возможность оперировать, нанося минимальные травмы больному. Этот атлас и предложенная Пироговым методика стали основой всего последующего развития оперативной хирургии.

В 1847 году Пирогов уехал на Кавказ в действующую армию, так как хотел проверить в полевых условиях разработанные им операционные методы. На Кавказе он впервые применил перевязку бинтами, пропитанными крахмалом. Крахмальная перевязка оказалась удобнее и прочнее, чем применявшиеся раньше лубки. Здесь же, в ауле Салта, Пирогов впервые в истории медицины начал оперировать раненых с эфирным обезболиванием в полевых условиях. Всего великий хирург провёл около 10 тыс. операций под эфирным наркозом.